การทดสอบทางวิทยาศาสตร์ครั้งต้น ๆ
การทดสอบวิทยาศาสตร์ครั้งแรกดำเนินการในปี ค.ศ. 1666 จิตรกรและนักวิทยาศาสตร์ของยุคนั้นจำนวนหนึ่งได้รับอนุญาตให้ตรวจวิเคราะห์ผ้าคลุมผืนนี้อย่างถ้วนถี่ ท่านเหล่านั้นประหลาดใจมากที่ตรวจพบว่าภาพวาดนี้ไม่มีการเตรียมพื้นฐานจึงไม่สามารถบอกได้ว่าพระฉายาลักษณ์วาดขึ้นด้วยสีหรือกาวน้ำ ยิ่งกว่านั้น ผ้าคลุมผืนนี้ทำด้วยเส้นใยที่เสื่อมคุณภาพเร็ว ซึ่งเมื่อคำนึงถึงภูมิอากาศชื้นที่สามารถกัดกร่อน แม้กระทั้งเหล็กได้แล้ว ผ้านี้ก็น่าจะเสื่อมโทรมไปแล้วภายในไม่กี่ปี แต่ว่าในขณะที่ทำการทดสอบทางวิทยาศาสตร์ครั้งต้นๆ นั้น เวลาได้ล่วงเลยไปแล้วถึง 135 ปี และเส้นใยผ้าก็ยังคงอยู่ในสภาพเดิม มีการตั้งข้อสังเกตนี้ในการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ครั้งหลังๆ ทุกครั้ง และยังสร้างความงุนงงอยู่แม้กระทั้งทุกวันนี้ สุดที่จะอธิบายได้ผ้าผืนนี้ทำด้วยเส้นใยเป็นผืนเดียวในชนิดของมันที่ยังมีตัวตนอยู่หลังจาก 471 ปี
เมื่อปี 1751 มีการวิจัยโดยวิศวกรชื่อดังเจ็ดท่านนำโดยมีกอล คาเปรรา ท่านเหล่านั้นบันทึกว่า ดูเหมือนว่าพระฉายาลักษณ์จะไม่ได้วาดขึ้นโดยน้ำมือของมนุษย์ สีทั้งหลาย ถูกทำให้รวมกัน เข้าไปในเส้นใย จิตรกรเหล่านั้นต้องการทำสำเนาของพระฉายาลักษณ์ แต่ก็ทำไม่ได้จริง ๆ การที่จะทำสำเนาลักษณะของพระฉายาลักษณ์อย่างซื่อสัตย์นั้นทำไม่ได้ เพราะสิ่งเหล่านั้นสร้างขึ้นโดยการใช้เทคนิคน่าพิศวงที่ไม่อาจจะอธิบายได้
ต่อมาอีก 40 ปี คือในปี 1791 มีเหตุการณ์เกิดขึ้น ซึ่งเผยให้เห็นสิ่งน่าประหลาดใจเพิ่มเติม คนงานจำนวนหนึ่งกำลังทำความสะอาดกรอบสีทองซึ่งบรรจุพระฉายาลักษณ์อยู่ในปี ค.ศ. 1771 ขณะที่พวกคนงานกำลังปฏิบัติภาระหน้าที่ โดยใช้น้ำยาประกอบด้วยกรดในตริก 50% น้ำยาสองสามหยดตกใส่พระฉายาลักษณ์ เพราะความพลั้งพลาดในทางเคมีของเหล่านี้น่าจะก่อให้เกิดความเสียหายสุดที่จะแก้ไขได้ ความจริงแล้วเมื่อกรดในตริกไปถูกโปรตีนที่มีอยู่ในวัสดุที่มีแหล่งกำเนิดจากสัตว์หรือพืชผัก มันจะทิ้งสีเหลืองไว้เป็นลักษณะจำเพาะ และทำความชำรุดให้กับวัถุเซลลูโลสที่บรรจุอยู่ในวัสดุนั้น แต่คราวนี้เหตุการณ์นี้มิได้เกิดขึ้นเลย ของเหลวซึ่งหยดลงใส่ผ้าคลุมผืนนั้นระเหยไปทิ้งร่องรอยที่เลือนลางไว้ซึ่งนานวันก็สูญหายไปหมด
ในปีค.ศ. 1936 ศาสตราจารย์ริชาร์ด คูนห์ ผู้อำนวยการกองเคมีของสถาบันไกเซอร์วิลเฮมในเมืองไฮเดลเบิร์ก ซึ่งต่อมาอีกสองปีได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมี ท่านได้รับโอกาสตรวจวิเคราะห์เส้นด้ายสองเส้น ที่นำเอามาจากผ้าคลุมไหล่ของยวง ดิเอโก สีแดงหนึ่งเส้นและสีเหลืองหนึ่งเส้นผลของการวิเคราะห์ โดยการใช้เทคโนโลยีที่ทันสมัยที่สุดของยุคนั้นเปิดเผยว่า เส้นด้ายสองเส้นนั้นไม่มีร่องรอยของการใส่สี ไม่ว่าจากพืชสัตว์หรือแร่ธาตุใดๆทั้งสิ้น
